Что такое световой микроскоп?

В течение последних 200 лет, с тех пор, как был создан конденсор Аббе, метод световой микроскопии является основным способом исследования в области цитологии, гистологии, эмбриологии и многих других биологических дисциплинах. Причем в последние десятилетия области применения световой микроскопии неуклонно расширяются. Сейчас трудно представить себе современную биологическую или медицинскую лабораторию, где бы не использовался этот прибор. В то же время значительная часть огромной армии исследователей, работающих с микроскопом, весьма смутно представляет себе теоретические основы и практические возможности метода.

А между тем, с помощью светового микроскопа можно рассмотреть частицы по размеру приближающиеся к четверти микрона. Это стало возможным благодаря многочисленным и крайне полезным изобретениям немецкого физика-оптика Эрнеста Аббе, который детскую забаву превратил в серьезный инструмент для исследований. Именно он научился рассчитывать линзы, позволяющие достигать дифракционного предела, определил понятие термина «числовая апертура», характеризующего эффективность ввода световых лучей в оптическое волокно.

В настоящее время световой микроскоп способен "показать" мельчайшие детали объектов, измерять образцы, определять коэффициенты преломления, массу и химический состав мельчайших частиц, фиксировать полученные данные на ПК. А самое последнее поколение микроскопов обладает возможностью автоматически сохранять и анализировать изображение.

Но, как известно, самая сложная часть исследования – получение реального изображения. И это является настоящим искусством, ведь от того, насколько контрастным и четким будет исходная картинка, будет зависеть качество дальнейшей работы. Для лучшего или большего контрастирования изображения используются дополнительные методы. 

Методы световой микроскопии

1. Темнопольная микроскопия, а также ее разновидность – ультрамикроскопия. Суть метода состоит в том, что для улучшения рассматривания мельчайших объектов используют мощные косые лучи, которые попадают в объектив не напрямую, а в виде отраженного от частиц свете. При этом сами частицы выглядят светящими на темном фоне. При помощи темнопольного метода удобно изучать живые объекты.
2. Фазово-контрастная микроскопия позволяет добиться максимальной контрастности изображения. В данном случае используется разница в преломлении света в разных средах. В одних средах он проходит почти без изменений, а в других – происходит сдвиг фазы колебаний. Эти сдвиги глазу исследователя незаметны, но при работе с фазово-контрастным микроскопом прозрачные структуры (с высоким показателем преломления) становятся более четкими и яркими по сравнению с окружающим фоном. Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать как живые, так и мертвые клетки и ткани.
3. Приблизительно на этом же эффекте построена интерференционная микроскопия. С помощью просветленного объектива микроскопа происходит разделение светового потока на два параллельных пучка. Один из них, проходя через объект, изменяет свои колебания, второй же, минует объект и не претерпевает изменений. Объединение лучей и их интерференция (за счет запаздывания по фазе одного из лучей) происходит в призмах. В результате, изображение получится разное по контрастности в зависимости от толщины и плотности участка клетки. Интерференционный микроскоп позволяет не только визуализировать образец, но и определить концентрацию сухого вещества в клетках.
4. Существует также метод поляризационной микроскопии, который позволяет заметить анизотропию (неоднородность) структуры различных образцов. Это могут быть костные и зубные препараты, образцы крови, мышечные волокна, кристаллы, минералы, полимеры. Такую возможность обеспечивают специальные призмы, которые способны поляризовать и анализировать свет. Поляризующая призма располагается под предметным столиком, а анализирующая расположена в тубусе микроскопа, при этом они могут вращаться относительно друг друга. Исследования всегда проводятся по методу светлого поля. Применение поляризованного света может обеспечить отличный контраст благодаря практически полному подавлению фонового свечения с помощью скрещенных поляризаторов, а также яркому и цветному высвечиванию препарата.
5. Ультрафиолетовая микроскопия использует способность некоторых микрочастиц поглощать свет с определенной длиной волны. При рассматривании препарата с кварцевой или зеркальной оптикой становятся доступны для исследования ранее невидимые частицы. Огромным достоинством такого метода микроскопии является тот факт, что для исследования препарат не нужно окрашивать, а значит, можно исследовать живые объекты.
6. Люминесцентная микроскопия прибегает к помощи специальных красителей – флюорохромов, но может работать и без них. Существуют структуры, которые изначально могут светиться при рассматривании их в синем или ультрафиолетовом свете, но некоторые составляющие клетки начинают проявлять флюоресценцию только при нанесении на них красителя. Важен тот факт, что красители используются в низких концентрациях, которые не оказывают токсического действия на клетки, и они остаются живыми. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии.

Практически невозможно в одной статье перечислить все методы, используемые в биологии и материаловедении, которые могут быть применены для получения контраста в живых препаратах. Все время появляются новые разработки, одна из наиболее интересных среди них — сканирующая световая микроскопия, которая дает особенно заметные преимущества для исследования толстых биологических препаратов. Теперь появилась возможность не просто зарегистрировать, что молекула есть, а и увидеть, как эта молекула движется в клетках и тканях.